ProteanFect™ Max转染人原代T细胞操作攻略
人原代T细胞在肿瘤免疫学和细胞工程等研究领域中至关重要。通过基因工程改造，T细胞可以有效治疗癌症、自身免疫等多种疾病。然而，基因转导方法常面临挑战，特别是在涉及复杂的多基因和多靶点研究时。ProteanFect™ Max是全球首款自组装蛋白纳米颗粒核酸转染试剂，作为一种非病毒、非电转、非脂质体的转染试剂，可高效、低毒、简便地将基因递送至原代T细胞中，尤其适用于大片段和多片段基因递送。本文将详细介绍如何使用ProteanFect™ Max实现人原代T细胞的高效转染。
实验前准备
对于人原代T细胞，合适的培养条件和激活方法对细胞的成功转染非常关键。T细胞转染前需要充分活化，以实现较高的转染效率。
人原代T细胞的分离与活化
人原代T细胞的分离：以来自全血或血沉棕黄层的单核细胞（MNCs）或外周血单核细胞（PBMCs）开始，可以使用市面上阴性选择或者阳性选择分离得到T 细胞亚群（包括 CD3+ T 细胞、CD4+ T 细胞或 CD8+ T 细胞）。
人原代T细胞的活化： CD3/CD28激活磁珠是一种常见的人T细胞活化剂，能够提供T细胞激活与扩增所需的主要和协同刺激信号，显著提高T细胞的活化和扩增效率。
人原代T细胞的培养与传代
1. T细胞培养与激活过程中，建议在培养基中添加人重组 IL-2，以刺激 T 细胞群的扩增。IL-2的使用浓度为300 IU/mL。在转染前，培养过程中无需去除激活磁珠。
2. 建议每2天对T细胞进行传代，保持细胞密度在1 × 106 /mL。
3. 推荐在T细胞激活后2-10天进行转染。如果细胞激活与传代时间过长，转染后的细胞活力与转染效率可能会降低。最佳转染时间为激活后4-7天，此时转染后的细胞活力和转染效率处于最佳水平。
使用ProteanFect Max进行人原代T细胞转染
1. 适合转染的核酸类型：包括mRNA和siRNA。双链DNA转染可能引发细胞毒性，因此原代T细胞不适合使用质粒DNA进行转染。
2. 适合转染的培养基：使用Opti-MEM培养基（或无血清RPMI 1640/无血清DMEM培养基）进行转染。提前预热或恢复至室温。
3. 配置ProteanFect转染体系：具体详见表1-3。由于T细胞对环境敏感，建议在转染液配置完成后再处理细胞。转染体系在配置过程中出现粘稠现象属于正常。
4. 细胞准备：确保细胞处于良好生长状态，活率需超过90%。调整细胞转染密度时，避免反复离心，以免延长处理时间，影响细胞活力和转染效率。
5. 细胞转染：孵育时间建议保持在15-30分钟，延长时间可能影响细胞活力。
6. 转染效率与细胞活率检测：使用阳性对照mRNA时，可在转染后5-48小时内观察EGFP的表达。细胞活率可通过镜下观察、台盼蓝染色或流式细胞术等方法检测，若细胞状态良好，镜下观察可见细胞呈现抱团生长状态。
表1. ProteanFect Max转染人原代T细胞实验操作步骤说明（以96孔板转染mRNA为例）
操作步骤 | 人原代T细胞转染 |
1 配置ProteanFect转染体系 | |
1.1 将Reagent A与mRNA混合 | 在40 µL Reagent A中加入0.5 µg mRNA，充分混匀（Reagent A使用前需颠倒混匀） |
1.2 加入Reagent B轻柔充分混匀 | 往上述混合物中加入0.7 μL Reagent B混匀 |
1.3 加入Reagent C混匀 | 往上述混合物中加入8 μL Reagent C混匀 |
2 细胞处理（转染体系制备完再进行细胞处理） | |
2.1 人原代T细胞准备（尽量去除FBS，以免影响转染效果） | 取待转染人原代T细胞，300 g离心5分钟，去上清，收集细胞沉淀，加入Opti-MEM（提前预热或恢复至室温）重悬并洗涤一次，细胞悬液调至5×10⁶ - 1×10⁷ cells/mL备用 |
3 细胞转染 | |
3.1混合转染体系与细胞 | 将上述ProteanFect转染液与20 µL细胞悬液混合均匀（可直接在离心管中孵育） |
3.2 孵育 | 37℃培养箱孵育15-30分钟 |
3.3 终止反应与洗涤 | 加入至少200 µL完全培养基，300 g离心5分钟，弃上清（为避免细胞损失，无需完全弃尽） |
3.4 细胞培养与观察 | 加入适量完全培养基，进行细胞培养，后续可根据实验目的进行基因表达检测 |
表2. ProteanFect Max转染不同类型核酸的实验操作步骤说明（以96孔板转染为例）
操作步骤 | 原代T细胞转染 | |
1 配置ProteanFect转染体系 | mRNAa | siRNAb |
1.1 将Reagent A与核酸混合 | 在40 µL Reagent A中加入0.5 µg mRNA，充分混匀 | 在40 µL Reagent A中加入20 pmol siRNA，充分混匀 |
1.2 加入Reagent B | 往上述混合物中加入0.7 μL Reagent B | 往上述混合物中加入0.7 μL Reagent B |
1.3 加入Reagent C | 往上述混合物中加入8 μL Reagent C | 往上述混合物中加入8 μL Reagent C |
2转染前细胞处理 | 详见表2 | |
3 细胞转染 | 详见表2 | |
a. 建议mRNA浓度≥1 μg/μL。如需同时转染多个mRNA，为确保在转染多个mRNA时保持高效的转染效果，加入的mRNA总量为0.5 µg。
b. 建议siRNA浓度≥20 μM。如需同时转染多个siRNA，为确保在转染多个siRNA时保持高效的转染效果，加入的siRNA总量为20 pmol。
表3. ProteanFect Max转染不同细胞培养孔板规格的各组分使用量
*大体系转染推荐使用离心管孵育
组分 | 孔板类型 | ||
Reagent A | 96孔 | 40 μL | |
48孔 | 80 μL | ||
24孔 | 200 μL | ||
12孔 | 600 μL | ||
6孔 | 800 μL | ||
待转染核酸 | 核酸类型 | mRNA | siRNA |
96孔 | 0.5 μg | 20 pmol | |
48孔 | 1 μg | 40 pmol | |
24孔 | 2.5 μg | 100 pmol | |
12孔 | 7.5 μg | 300 pmol | |
6孔 | 10 μg | 400 pmol | |
Reagent B | 96孔 | 0.7 μL | 0.7 μL |
48孔 | 1.4 μL | 1.4 μL | |
24孔 | 3.5 μL | 3.5 μL | |
12孔 | 10.5 μL | 10.5 μL | |
6孔 | 14 μL | 14 μL | |
Reagent C | 96孔 | 8 μL | |
48孔 | 16 μL | ||
24孔 | 40 μL | ||
12孔 | 120 μL | ||
6孔 | 160 μL | ||
推荐每孔细胞数（Opti-MEM） | 96孔 | 1×105 - 2×105（20 μL） | |
48孔 | 2×105 - 4×105（40 μL） | ||
24孔 | 5×105 - 1×106（100 μL） | ||
12孔 | 1.5×106 - 3×106（300 μL） | ||
6孔 | 2×106 - 4×106（400 μL） | ||
使用ProteanFect Max转染EGFP mRNA至人原代T细胞实例
特别提示：本文所提及的品牌货号仅供参考，用户可根据实验需求进行选择。
（1） 实验前准备
本实验T细胞培养的培养基成分如表4所示。
表4. 人原代T细胞培养培养基成分
成分 | 品牌货号 |
X-VIVOTM 15 培养基 | Lonza，04-418Q |
FBS，10% | Gibco™, 10099141C |
注射用人白介素2，300 IU/mL | / |
青霉素-链霉素-新霉素（PSN）抗生素混合物（可选） | GibcoTM, 15640055 |
（2） 分离与活化
本实验所用细胞分离和活化试剂盒为Dynabeads™ Human T-Expander CD3/CD28（Thermo Fisher, 11141D）。具体实验操作参考其官方说明书。
（3） 培养与传代
T细胞激活后2-10天都可进行转染。最佳转染时间为激活后4-7天，此时转染后的细胞活力和转染效率处于最佳水平。本次实验在磁珠激活后6天转染。
（4） 细胞转染
使用ProteanFect Max转染阳性对照EGFP mRNA具体步骤参照表1。
（5） 细胞活率和表达效率分析
在转染 EGFP mRNA后，可通过荧光显微镜和流式细胞术对T细胞转染后的细胞活力与转染效率进行分析。首先通过荧光显微镜对转染后T细胞的EGFP蛋白质表达、细胞形态和活力进行定性评估（图 1）。同时，收集转染后的细胞进行流式检测以定量分析其转染效率。细胞收集完成后，离心弃去培养基，用1 × DPBS重悬细胞，进行流式检测（图2）。
在转染 EGFP mRNA后，可通过荧光显微镜和流式细胞术对T细胞转染后的细胞活力与转染效率进行分析。首先通过荧光显微镜对转染后T细胞的EGFP蛋白质表达、细胞形态和活力进行定性评估（图 1）。同时，收集转染后的细胞进行流式检测以定量分析其转染效率。细胞收集完成后，离心弃去培养基，用1 × DPBS重悬细胞，进行流式检测（图2）。
图1. 利用ProteanFect转染EGFP mRNA在人原代T细胞中的表达。荧光图（左）和明场图（右）显示，ProteanFect转染人原代T细胞1天后，细胞成团生长，说明转染后细胞活率较高，增殖不受转染影响。绝大部分细胞表达绿色荧光蛋白，说明ProteanFect在人原代T细胞中具有较高的转染效率。
图2. 利用ProteanFect转染EGFP mRNA在人原代T细胞中表达的流式分析图。使用ProteanFect转染试剂在人原代T细胞中转染EGFP mRNA，在转染后5小时即有较强表达，绿色荧光蛋白长效表达至少12天。
常见问题
1. 如何提升转染效率
1）延长转染时间：根据细胞状态适当延长转染时间，通常不超过45分钟。
2）提升Reagent C用量：以96孔板为例，可将Reagent C体积增加至13.5 μL，孵育时间15分钟最佳。
2. 质粒DNA能否用于原代细胞转染
双链DNA转染原代T细胞可能会引起一定的毒性，例如炎症应激等，因此需根据实验目的谨慎选择。
3. 原代T细胞转染前预处理
人原代T细胞可使用CD3/CD28磁珠进行激活，激活2-10天内均可转染，其中激活4-7天时转染效率最高。
4. 关于试剂盒中阳性对照的使用建议
首次尝试时，建议设置阳性对照组（EGFP mRNA），以检测实验操作和试剂的有效性。使用96孔板的细胞量即可，节省细胞和试剂。
5. 转染时的细胞数范围
说明书中提供了最佳转染条件下的细胞数量范围，但在特殊情况下，即使细胞数量较少，也可以进行转染。以96孔板为例，建议细胞数量不低于4×10³/孔，以确保后续检测的可靠性。
6. 转染后细胞状态与活力
转染后，细胞状态可能与未处理组略有差异。但使用ProteanFect试剂进行转染时，对细胞活力的损伤较小。通常在转染后第二天，细胞状态会基本恢复。
7. 转染后细胞离心后看不到沉淀
对于小体积转染体系（如96孔板），离心后细胞沉淀不明显是正常现象。细胞沉淀可能散落在离心管侧壁，不影响后续结果。为减少细胞损失，离心后移液时应避免枪头紧贴底部。
8. 转染体系扩大是否影响转染效率
如转染细胞量较大，推荐使用离心管进行孵育，转染体系参照表3，不会影响转染效率。
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