ProteanFect™ Max小鼠原代免疫细胞转染试剂盒转染小鼠原代T细胞使用攻略
近年来，随着免疫学领域的深入发展，越来越多的研究倾向于在免疫健全动物（如C57BL/6和BALB/c小鼠）中开展T细胞药物的功效探索，如CAR-T细胞疗法。这一趋势显著增加了对小鼠原代T细胞基因递送技术的需求。然而，小鼠原代T细胞的基因转染仍面临诸多挑战，特别是在多基因和多靶点实验中，现有方法往往难以兼顾高效性和稳定性。ProteanFect™ Max小鼠原代免疫细胞转染试剂盒是全球首款基于自组装蛋白纳米颗粒的核酸转染试剂。作为一种非病毒、非电转、非脂质体的转染试剂，ProteanFect™ Max小鼠原代免疫细胞转染试剂盒可高效、低毒、简便地将基因递送至小鼠原代T细胞中，尤其适用于大片段和多片段基因递送。本文将详细介绍如何使用ProteanFect™ Max小鼠原代免疫细胞转染试剂盒（货号PT03）实现小鼠原代T细胞的高效转染。
实验前准备
对于小鼠原代T细胞，合适的培养条件和激活方法对细胞的成功转染非常关键。T细胞转染前需要充分活化，以实现较高的转染效率。
小鼠原代T细胞的分离与活化
T细胞的分离：以来自小鼠脾脏白细胞开始，可以使用市面上阴性选择或者阳性选择分离得到T 细胞亚群（包括 CD3+ T 细胞、CD4+ T 细胞或 CD8+ T 细胞或调节性 T 细胞）。
T细胞的活化：
磁珠激活： CD3/CD28激活磁珠能够提供T细胞激活与扩增所需的主要和协同刺激信号，显著提高T细胞的活化和扩增效率。
抗体激活：使用CD3/CD28抗体刺激 T 细胞，模拟 T 细胞活化的双信号作用，也是进行 T 细胞激活与扩增应用广泛的方法。
小鼠原代T细胞的培养与传代
1. T细胞培养与激活过程中，建议在培养基中添加人重组 IL-2，以刺激 T 细胞群的扩增。IL-2的使用浓度为300 IU/mL。
2. 建议每2天对T细胞进行传代。
3. 推荐在T细胞激活后2-4天进行转染。如果细胞激活与传代时间过长，转染后的细胞活力与转染效率可能会降低。
使用ProteanFect Max小鼠原代免疫细胞转染试剂盒进行小鼠原代T细胞转染
1. 适合转染的核酸类型：包括mRNA和siRNA。双链DNA转染可能引发细胞毒性，因此原代T细胞不适合使用质粒DNA进行转染。
2. 适合转染的培养基：使用Opti-MEM培养基（或无血清RPMI 1640/无血清DMEM培养基）进行转染。提前预热或恢复至室温。
3. 配置ProteanFect Max（for Mouse Primary T Cell）转染体系：具体详见表1-3。由于T细胞对环境敏感，建议在转染液配置完成后再处理细胞。配置前如观察到Reagent C（for Mouse T cell）溶液有析出，室温或加热（65℃水浴）至完全溶解后使用。转染体系在配置过程中出现粘稠现象属于正常。
4. 细胞准备：确保细胞处于良好生长状态，活率需超过90%。调整细胞转染密度时，避免反复离心，以免延长处理时间，影响细胞活力和转染效率。
5. 细胞转染：孵育时间建议保持在15-30分钟，延长时间可能影响细胞活力。
6. 转染效率与细胞活率检测：使用阳性对照mRNA时，可在转染后5-48小时内观察EGFP的表达。细胞活率可通过镜下观察、台盼蓝染色或流式细胞术等方法检测，若细胞状态良好，镜下观察可见细胞呈现抱团生长状态。
表1. 使用ProteanFect Max小鼠原代免疫细胞转染试剂盒转染小鼠原代T细胞实验操作步骤说明（以96孔板转染mRNA为例）
操作步骤 | 小鼠原代T细胞转染 |
1 配置ProteanFect Max (for Mouse Primary T Cell) 转染体系 | |
1.1 将Reagent A (for Mouse Primary T Cell) 与mRNA混合 | 在40 µL Reagent A (for Mouse Primary T Cell) 中加入0.5 µg mRNA，充分混匀（Reagent A使用前需颠倒混匀） |
1.2 加入Reagent B (for Mouse Primary T Cell) 轻柔充分混匀 | 往上述混合物中加入0.7 μL Reagent B (for Mouse Primary T Cell) 混匀 |
1.3 加入Reagent C (for Mouse Primary T Cell) 混匀 | 往上述混合物中加入10 μL Reagent C（for Mouse Primary T Cell）混匀 |
2 细胞处理（转染体系制备完再进行细胞处理） | |
2.1 小鼠原代T细胞准备（尽量去除FBS，以免影响转染效果） | 取待转染小鼠原代T细胞，300 g离心5分钟，去上清，收集细胞沉淀，加入Opti-MEM（提前预热或恢复至室温）重悬并洗涤一次，细胞悬液调至1×107 – 1.5×10⁷ cells/mL备用 |
3 细胞转染 | |
3.1混合转染体系与细胞 | 将上述ProteanFect转染液与20 µL细胞悬液混合均匀（可直接在离心管中孵育） |
3.2 孵育 | 37℃培养箱孵育15-30分钟 |
3.3 终止反应与洗涤 | 加入至少200 µL完全培养基，300 g离心5分钟，弃上清（为避免细胞损失，无需完全弃尽） |
3.4 细胞培养与观察 | 加入适量完全培养基，进行细胞培养，后续可根据实验目的进行基因表达检测 |
表2. 使用ProteanFect Max小鼠原代免疫细胞转染试剂盒转染不同类型核酸的实验操作步骤说明（以96孔板转染为例）
操作步骤 | 原代T细胞转染 | |
1 配置ProteanFect (for Mouse Primary T Cell) 转染体系 | mRNAa | siRNAb |
1.1 将Reagent A (for Mouse Primary T Cell) 与核酸混合 | 在40 µL Reagent A (for Mouse Primary T Cell) 中加入0.5 µg mRNA，充分混匀 | 在40 µL Reagent A (for Mouse Primary T Cell) 中加入20 pmol siRNA，充分混匀 |
1.2 加入Reagent B (for Mouse Primary T Cell) | 往上述混合物中加入0.7 μL Reagent B (for Mouse Primary T Cell) | 往上述混合物中加入0.7 μL Reagent B (for Mouse Primary T Cell) |
1.3 加入Reagent C（for Mouse Primary T Cell） | 往上述混合物中加入10 μL Reagent C（for Mouse Primary T Cell） | 往上述混合物中加入10 μL Reagent C（for Mouse Primary T Cell） |
2转染前细胞处理 | 详见表2 | |
3 细胞转染 | 详见表2 | |
a. 建议mRNA浓度≥1 μg/μL。如需同时转染多个mRNA，为确保在转染多个mRNA时保持高效的转染效果，加入的mRNA总量为0.5 µg。
b. 建议siRNA浓度≥20 μM。如需同时转染多个siRNA，为确保在转染多个siRNA时保持高效的转染效果，加入的siRNA总量为20 pmol。
表3. 使用ProteanFect Max小鼠原代免疫细胞转染试剂盒转染不同细胞培养孔板规格的各组分使用量
*大体系转染推荐使用离心管孵育
组分 | 孔板类型 | 体积 | ||
Reagent A (for Mouse Primary T Cell) | 96孔 | 40 μL | ||
48孔 | 80 μL | |||
24孔 | 200 μL | |||
12孔 | 600 μL | |||
6孔 | 800 μL | |||
待转染核酸 | 核酸类型 | mRNA | siRNA | |
96孔 | 0.5 μg | 20 pmol | ||
48孔 | 1 μg | 40 pmol | ||
24孔 | 2.5 μg | 100 pmol | ||
12孔 | 7.5 μg | 300 pmol | ||
6孔 | 10 μg | 400 pmol | ||
Reagent B (for Mouse Primary T Cell) | 96孔 | 0.7 μL | ||
48孔 | 1.4 μL | |||
24孔 | 3.5 μL | |||
12孔 | 10.5 μL | |||
6孔 | 14 μL | |||
Reagent C（for Mouse Primary T Cell） | 96孔 | 10 μL | ||
48孔 | 20 μL | |||
24孔 | 50 μL | |||
12孔 | 150 μL | |||
6孔 | 200 μL | |||
推荐每孔细胞数（Opti-MEM） | 96孔 | 2×105~3×105（20 μL） | ||
48孔 | 4×105~6×105（40 μL） | |||
24孔 | 1×106~1.5×106（100 μL） | |||
12孔 | 3×106~4.5×106（300 μL） | |||
6孔 | 4×106~6×106（400 μL） | |||
使用ProteanFect Max 小鼠原代免疫细胞转染试剂盒转染EGFP mRNA至小鼠原代T细胞实例1——基于CD3/CD28抗体激活小鼠T细胞
特别提示：本文所提及的品牌货号仅供参考，用户可根据实验需求进行选择。
（1） 实验前准备
本实验T细胞培养的培养基成分如表4所示。
表4. 小鼠原代T细胞培养培养基成分
成分 | 品牌货号 |
X-VIVOTM 15 培养基 | Lonza，04-418Q |
FBS，10% | Gibco™, 10099141C |
注射用人白介素2，300 IU/mL | / |
青霉素-链霉素-新霉素（PSN）抗生素混合物（可选） | GibcoTM, 15640055 |
（2） 分离与活化
本实验所用细胞分离试剂盒为EasySep™ Mouse T Cell Isolation Kit（Stem Cell, 19851），具体实验操作参考其官方说明书。采用抗体激活的方法，抗体信息为anti-mouse CD3 (Invivo Mab, BE0002)，anti-mouse CD28 (Invivo Mab, BE0015-1)。具体操作步骤如下：
抗体包被：在24孔板中，用PBS润洗两次后，加入抗体稀释液（1:1000，anti-mouse CD3/CD28抗体稀释于PBS中，稀释后对应的抗体浓度为anti-mouse CD3：8.42 μg/mL，anti-mouse CD28：9.06 μg/mL），每孔400-500 μL，置于37°C放置5小时。
细胞活化：小鼠脾脏中分选出的T细胞用完全培养基重悬，调整细胞密度至2 × 106 /mL。取出包被好的24孔板，弃去包被液，每孔加入1 mL T细胞悬液，继续培养充分激活T细胞。
（3） 培养与传代
细胞在上述培养基中，抗体激活至第2天进行转染。激活和未激活小鼠原代T细胞形态如图1所示。
图1. 小鼠原代T细胞未激活和经抗体激活后的细胞明场图。激活2天后的小鼠原代T细胞通常会比未激活的细胞更大，且已经开始形成细胞团块。
（4） 细胞转染
使用ProteanFect Max 小鼠原代免疫细胞转染试剂盒转染阳性对照EGFP mRNA的具体步骤参照表1。
（5） 表达效率分析
在转染 EGFP mRNA 24小时后，收集细胞进行流式检测以定量分析其转染效率。细胞收集完成后，离心弃去培养基，用1 × DPBS重悬细胞，进行流式检测（图2）。
图2. 利用ProteanFect Max 小鼠原代免疫细胞转染试剂盒转染EGFP mRNA至小鼠原代T细胞（抗体激活）中EGFP表达的流式分析图。小鼠原代T细胞经抗体激活2天后，分别进行15分钟和30分钟的转染处理；在转染后24小时检测到EGFP蛋白表达率分别为63%和77%。
使用ProteanFect Max 小鼠原代免疫细胞转染试剂盒转染EGFP mRNA至小鼠原代T细胞实例2——基于CD3/CD28磁珠激活小鼠T细胞
特别提示：本文所提及的品牌货号仅供参考，用户可根据实验需求进行选择。
（1） 实验前准备
本实验T细胞培养的培养基成分如表4所示。
（2） 分离与活化
本实验采用磁珠激活的方法。所用细胞分离和活化试剂盒为Dynabeads™ Mouse T-Expander CD3/CD28（Thermo Fisher, 11452D）。具体实验操作参考其官方说明书。
（3） 培养与传代
细胞在上述培养基中，磁珠持续激活至第3天进行转染。
（4） 细胞转染
使用ProteanFect Max 小鼠原代免疫细胞转染试剂盒转染阳性对照EGFP mRNA的具体步骤参照表1；原代小鼠T细胞收集前用磁力架去除磁珠。
（5） 细胞活率和表达效率分析
在转染 EGFP mRNA后，可通过荧光显微镜和流式细胞术对T细胞转染后的细胞活力与转染效率进行分析。首先通过荧光显微镜对转染后T细胞的EGFP蛋白质表达、细胞形态和活力进行定性评估（图 3）。同时，收集转染后的细胞进行流式检测以定量分析其转染效率。细胞收集完成后，离心弃去培养基，用1 × DPBS重悬细胞，流式检测（图4）。
图3. 利用ProteanFect Max 小鼠原代免疫细胞转染试剂盒转染EGFP mRNA至小鼠原代T细胞（磁珠激活）后的显微图像。荧光图（左）和明场图（右）显示，小鼠原代T细胞在转染1天后，细胞成团生长，说明转染后细胞活率较高，增殖不受转染影响。绝大部分细胞表达绿色荧光蛋白，说明ProteanFect Max 小鼠原代免疫细胞转染试剂盒在小鼠原代T细胞中具有较高的转染效率。
图4. 利用ProteanFect Max 小鼠原代免疫细胞转染试剂盒转染EGFP mRNA至小鼠原代T细胞（磁珠激活）中EGFP表达的流式分析图。小鼠原代T细胞磁珠激活3天后进行转染，在转染后24小时检测到约有69.9%细胞表达EGFP蛋白。
常见问题
1. 如何提升转染效率
延长转染时间：根据细胞状态适当延长转染时间，通常不超过45分钟。
2. 质粒DNA能否用于原代细胞转染
双链DNA转染原代T细胞可能会引起一定的毒性，例如炎症应激等，因此需根据实验目的谨慎选择。
3. 原代T细胞转染前预处理
小鼠原代T细胞可使用CD3/CD28磁珠或抗体进行激活，激活2-4天内均可转染。可根据实验结果选择最佳转染时间。
4. 关于试剂盒中阳性对照的使用建议
首次尝试时，建议设置阳性对照组（EGFP mRNA），以检测实验操作和试剂的有效性。使用96孔板的细胞量即可，节省细胞和试剂。
5. 转染时的细胞数范围
说明书中提供了最佳转染条件下的细胞数量范围，但在特殊情况下，即使细胞数量较少，也可以进行转染。以96孔板为例，建议细胞数量不低于4×10³/孔，以确保后续检测的可靠性。
6. 转染后细胞状态与活力
转染后，细胞状态可能与未处理组略有差异。但使用ProteanFect试剂进行转染时，对细胞活力的损伤较小。通常在转染后第二天，细胞状态会基本恢复。
7. 转染后细胞离心后看不到沉淀
对于小体积转染体系（如96孔板），离心后细胞沉淀不明显是正常现象。细胞沉淀可能散落在离心管侧壁，不影响后续结果。为减少细胞损失，离心后移液时应避免枪头紧贴底部。
8. 转染体系扩大是否影响转染效率
如转染细胞量较大，推荐使用离心管进行孵育，转染体系参照表3，不会影响转染效率。
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